2017年12月22日

微小な生体組織を人工的に組み立てる新手法を開発～　生体にやさしく柔軟性の高い材料で立体構造を自在に作製し、細胞の内包化と長期培養に成功　～

日本電信電話株式会社（本社：東京都千代田区、代表取締役社長：鵜浦博夫、以下　NTT）は、生体適合性の高い高分子薄膜のみを用いて立体構造を作製し、その構造内に細胞を内包して長期培養することで、マイクロ～センチメートルスケールの微小な心筋や神経の生体組織を再構築する手法の開発に成功しました。
　本成果では、生体内埋め込み材料として広く用いられてきた、シルクフィブロインゲル^※1とパリレン^※2という二種類の高分子薄膜を積層し、そのパターン形状と厚みに応じ、任意の三次元構造に組み立てられるソフトな薄膜の立体構造を作製することに成功しました。生体にやさしく、柔軟性の高い材料で立体構造を自在に作製することが可能になれば、生体組織の表面形状にフィットする生体内埋め込み素子や細胞培養用のフレキシブル基板などへの応用が期待されます。
　さらに、この立体構造内に細胞を内包し長期培養することで、構造体内部で徐々に細胞同士が凝集し生体組織の微小な構造を人工的かつ自己組織的に形成できることを見出しました。例えば、内部に心筋細胞を培養することで心筋ファイバを再構成したり、さらに海馬の細胞を内部で培養することで、微小な神経組織を作製することに成功しました。得られた知見は、幹細胞を用いた再生医療の基盤技術や、外部電場や磁場に応答する機能的な生体埋め込み素子など、新たな生体インタフェースの創生に繋がると期待されます。
　この成果は、2017年12月22日午前10時（英国時間）に英国科学誌「サイエンティフィック・リポーツ（Scientific Reports）」オンライン版で公開されます。

研究の背景

細胞を三次元の立体構造に組み上げて、一つの生体組織に近い構造を人工的に作る技術は、創薬や再生医療、移植治療などの幅広い分野において必要不可欠となっています。従来、細胞が凝集した塊（凝集塊）を形成するために、一つ一つの細胞を操作して微小な溝構造を有する鋳型の内部に細胞を内包する手法や、インクジェットプリンタによる細胞吐出法を用いて細胞を並べる手法が広く用いられていきました。しかし、これらの手法では立体形状の精度を高めることが難しく、細胞凝集塊を任意の形状に作製できないという課題がありました。一方、シリコンやガリウムヒ素などの無機材料の薄膜を用いる手法では、材料の弾性係数の違いを利用して厚み方向に歪みを誘導することで、任意の立体構造に自己組織的に組み立てること（自己組み立て）ができます。この手法では、数百ナノメートル程度の精度で形状の制御が可能となることが知られています。ただし、薄膜を作製する過程で用いる材料が生体適合性に乏しいことから、細胞や生体組織などの生体試料への用途展開はかなり制限されていました。生体と適合性の高いハイドロゲル^※3などの柔らかい材料を用いて、任意の立体構造を自在に作製することが可能になれば、生体組織の表面形状にフィットする生体内埋め込み素子や細胞培養基板などの生体にやさしいインタフェースの作製が可能となると考えられています。

研究の成果

今回、自己組み立ての原理に着目し、その手法を生体にやさしい高分子材料に適用することで、高分子材料だけで構成された立体形状を自発的に組み立てる手法を見出しました。さらに、自己組み立てと同時に立体構造内部に細胞を内包し培養することで（図1）、立体構造体を鋳型とした生体組織様の構造を人工的に作製することに成功しました。

行った実験の説明

本研究で用いる薄膜の材料として、絹糸から精製されたシルクフィブロインゲルと、ポリパラキシレン（パリレン）の2種類の高分子材料を利用しました。これらとともに、基板との接着材となるアルギン酸カルシウムゲル^※4の薄膜を加えた3種類が積層された高分子薄膜を基板上に作製しました。高分子が積層した薄膜は、フォトリソグラフィ技術を用いることで任意の二次元のパターン形状に成型加工が可能となります（図2）。
アルギン酸カルシウムゲルは、エチレンジアミン四酢酸^※5などを用いて溶解することが可能です。これにより細胞毒性のない反応によって基板からシルクフィブロインゲルとパリレンを張り合わせた薄膜のみを遊離することができます。エチレンジアミン四酢酸を添加した後、薄膜の外周から徐々にアルギン酸カルシウムゲルが溶解されていき、それと同時に薄膜が立体構造に変形していくことを観察しました。

図1　薄膜の自己組み立ての原理を用いた細胞の内包化

材料や厚みなどのパラメータを制御することで、薄膜を一方向に屈曲する現象を利用します。これにより二次元薄膜パターンの設計により、様々な三次元構造体の作製が可能になり、その内部での細胞の内包化が可能となります。

図2：自己組み立てを行う薄膜の作製工程

（Step 1-4）シルクフィブロインゲル、パリレン、アルギン酸カルシウムゲルの3層を積層化します。リソグラフィ技術を用いて加工を施し、任意の二次元パターンを作製します。（Step 5-8）エチレンジアミン四酢酸を用いて、アルギン酸カルシウムゲル層を除去し、薄膜が基板から遊離します。

図3：二次元薄膜を用いた任意の形状の立体構造の作製

（a）長方形形状の薄膜を用いた筒状構造体の作製　（b）ヒト型を模した二次元パターンの三次元自己組み立て

図4：細胞の内包化

エチレンジアミン四酢酸によるアルギン酸カルシウムゲル層の除去に伴い、薄膜が筒状構造体へと変形します。それと同時に表面付近に存在していた細胞を取り込んで内包化します。

図5：微小心筋組織の再構築

（左図）筒状構造体内部で培養された心筋細胞の位相差顕微鏡像と、細胞の拍動の変位量を表示した白黒画像。（右図）細胞の拍動の変位量を示すグラフ。心筋細胞を内包した筒状構造体では、内部で細胞同士が結合し、ファイバ状の生体組織様構造を形成します。心筋同士は一体となって拍動し、そのリズムは同期して一定になります。

技術のポイント：細胞にやさしい立体構造の自己組み立て手法

技術のポイント（1）：薄膜パターンの設計により、三次元構造の制御が可能

本研究での薄膜の立体構造体への自己組み立てという現象は、2層の薄膜の弾性係数の差に起因して、薄膜の厚み方向に内部応力の勾配が形成され、自発的に変形する仕組みを利用しています。例えば長方形のパターン形状では、短辺方向に薄膜が曲り、筒状の構造に自発的に組み立てられます（図3（a））。その曲率半径は、高分子の弾性係数や薄膜の厚み、薄膜の二次元パターン形状によって規定されることが分かりました。また、放射状パターンでは球状の構造に変形し、ヒンジで結合した長方形状パターンでは人形型の構造へ変形するなど、二次元パターン形状に対応した立体構造を自在に作製できることを実証しました（図3（b）、動画1）。

技術のポイント（2）：細胞に毒性を示さない方法で細胞の内包化が可能

今回のアルギン酸カルシウムゲル層の除去方法は、細胞に毒性を示さないため薄膜の自己組み立てのプロセスの間に一度に複数の細胞を立体構造体の内部に包含することが可能となります（図4、動画2）。内包する細胞は、一般的に生物学の研究で用いられている培養株化細胞だけでなく、生体組織から直接単離した初代培養細胞にも適用が可能です。また内包する細胞の密度や鋳型となる立体構造体の形状を制御することで、任意の形状の細胞塊を作製することが可能です。
　筒状構造体に内包された細胞は、一週間ほどの培養を経て、細胞独自の機能を持つ生体組織様構造に変化していきます。本研究では、一例として初代心筋細胞を用い、筒状構造体の内部で細胞同士が凝集し、その後一本の微小な心筋ファイバとして構造体を形成することを実証しました（図5、動画3）。さらに、その心筋ファイバ内の細胞が同期して拍動する様子や、拍動と同一周期で細胞内カルシウム振動が起こる細胞間相互作用を観測しました。また、初代培養海馬細胞を筒状構造体の内部で培養することで、長期培養の過程で細胞体同士が結合して細胞塊を形成し、それに続いて神経突起が構造体内外で伸展していくことを観察しました（動画4）。この海馬細胞から構成される細胞塊は、神経突起で結合された細胞同士が外部からの刺激に対して同時に反応することから、再構成した微小な神経組織における細胞間相互作用を示します。この筒状構造体の形成工程や材料は細胞に毒性を示さないため、筒状構造体内部での細胞の長期培養が可能となります。

技術のポイント（3）：微小組織構造体のハンドリング技術

構造体内部で形成された細胞塊は、ガラスの管であるキャピラリを用いて捕捉し、他の所望の場所へ容易に移動させることも可能です（動画5）。そのため、細胞を内包化した筒状同士を隣接させ、細胞が接続することで、人工的な神経回路が形成でき、また任意の生体組織のような三次元の構造も自在に作り上げることができます。本技術を様々な細胞の内包化に応用することで、生体組織内埋込みデバイスなどの多様な機能を有するバイオインタフェースへの応用が期待されます。

今後の展開

生体適合性の高い高分子材料を自発的に、かつ任意の形状に立体構造を形成させ、さらに内包した細胞の集団を自在に操作できる本手法は、再生医療分野や単一細胞の挙動解析のための足場構造としての応用が可能となります。さらに本研究で用いた高分子材料に、導電性や磁場応答性などの機能を付与することで、生体埋め込み素子の機能を拡充した新たな生体インタフェースとしての応用が期待されます。

論文掲載情報

著者名	：	Tetsuhiko F. Teshima, Hiroshi Nakashima, Yuko Ueno, Satoshi Sasaki, Calum S. Henderson, and Shingo Tsukada
タイトル	：	Cell Assembly in Self-foldable Multi-layered Soft Micro-rolls
論文誌名	：	Scientific Reports
掲載日時	：	2017年12月22日午前10時（英国時間）

用語解説

^※1...シルクフィブロインゲル
　シルクフィブロインは、シルクのタンパク質のうち約70 %を占める主要タンパク質で、繊維状の構造をしており、シルクの高い引張強度や伸縮性、吸水性に寄与していると考えられます。生体親和性がとても高く、細胞を培養するための基板や組織再生を促す人工皮膚などに応用されています。シルクフィブロインを水溶液に溶かし、薄膜化した後にゲル化させたものをシルクフィブロインゲルと呼びます。

^※2...ポリパラキシレン（パリレン）
　直鎖状の結晶構造を持つ高分子で、高い絶縁性や湿気や化学物質のバリア性を有します。さらに耐熱性、耐紫外線性に優れるだけでなく、高い生体適合性を有することから、コーティング剤として、医療をはじめとした幅広い産業分野で利用されています。

^※3...ハイドロゲル
　高分子同士が絡み合って連結することで網目構造をとり、その内部に水を含む高分子物質の総称です。三次元状の小さな網目構造を持っているため、水分子を内部に包含することで膨潤した状態になり、高い流動性や粘弾性を持ちます。

^※4...アルギン酸カルシウムゲル
　アルギン酸は昆布やわかめなどの海藻から取れる多糖類で、マンヌロン酸とグルロン酸の2種類の単糖が直鎖上に結合した高分子です。アルギン酸カルシウムゲルは、カルシウムイオンにより架橋した状態で、ゲルとして水を含んで膨潤することができます。この材料をシルクフィブロインゲルとパリレンが積層した薄膜とガラス基板の間に形成することで、エチレンジアミン四酢酸をもちいて除去することによって、細胞毒性がない方法で薄膜をガラス基板から遊離させることが可能になります。

^※5...エチレンジアミン四酢酸
　エチレンジアミン四酢酸は通称EDTA 又はエデト酸と呼ばれるキレート剤であり、特にカルシウムなどの二価イオンと強く結合して錯体を形成する特徴をもちます。重金属の錯化除去を目的として繊維パルプや医薬食品など工業的に広く用いられている他、カルシウムの除去や酵素の不活化を目的として生物学分野で用いられています。本研究ではアルギン酸カルシウム層（※4）中のカルシウムの除去することで、層の溶解と薄膜の遊離化を行うために用いられています。