ナノ薄膜の立体構造を鋳型とした人工神経ネットワークの形成に成功 ～再生医療技術を支援する新しい生体インターフェースの実現に期待～

研究の背景

近年の医療技術の進歩とAIに代表される情報処理技術の進展に伴い、生体組織に直接アクセスして信号を取得したりモニタリングしたりするための生体インターフェースの実現への要望が高まっています。生体インターフェースでは、丈夫で柔らかい人工的な微細構造物で生体組織を保護しなくてはなりませんが、その目的に適合した材料の探索が世界中で盛んになされています。
　一方で、二次元の機能性材料の一種であるグラフェンは、原子一層からなる極めて薄いシート状の導電性材料であり、高透明性、高強度、耐薬品性、耐熱性、柔軟性、生体適合性を有する特徴から、シリコンや貴金属の代替としてトランジスタやバッテリ、センサ素子としての応用が期待されています。しかしながら、極薄の二次元シート状であることから、実際にデバイスとして活用する際に、高精細に三次元構造に組み上げ微細化することが困難とされていました。
　従来の研究では、グラフェンを自在にかつ簡単に加工・屈曲させるための手法は確立されておらず、三次元化する際にナノスケールの薄膜であるグラフェン自身の破断などを引き起こす技術的課題がありました。もしこれらの課題を解決して微小なグラフェンの三次元構造を任意に作製できるようになると、生体との親和性を活かして、マイクロスケールの細胞などの生体材料の表面にフィットする生体内埋め込み素子や、細胞培養基板などのインターフェースとして用いることが可能です。そのため、再生医療や医療・治療用デバイスなどのバイオ分野での応用が広く期待されます。

研究の成果

本研究では、グラフェンを微細な三次元構造に組み立てる手法として、グラフェンと強く密着するパリレン高分子薄膜に転写し、基板から剥離するだけで三次元に変形させる非常にシンプルな方法を発見しました。パリレン表面に転写されたグラフェンは、材料の弾性係数の違いで厚み方向に歪みが誘起され、自己組織的に三次元構造に組み立てられます（自己組み立て）。今回、高分子薄膜の厚みを変えることで、グラフェンを最小4µmほどの曲率半径まで微細に折り曲げることが可能となりました（図1、動画1）。さらに、本技術で使用した素材はすべて生体にやさしく、柔軟性が高い材料である特長があります。そこで三次元に組み立てられたグラフェンを、生体試料の一種である細胞とのインターフェースとして用いました。自己組み立てと同時にグラフェンの三次元構造内に細胞を内包化し、その構造の内部で細胞を長期間、安定して閉じ込めて培養することが可能となりました。特に神経細胞を内包化することにより、三次元構造体を鋳型とした微小な神経組織様構造を人工的に再構成することに成功し、構造体内外にてネットワーク形成を行い、細胞間相互作用を示すことを確認しました。

技術のポイント：グラフェンを用いた三次元構造の自己組み立て手法

技術のポイント（1）：高分子薄膜を用いた三次元構造化とその制御

自己組み立てされる最終的な三次元形状は、もとの薄膜の二次元パターン形状や薄膜の厚みに依存することが分かりました。例えばパリレン薄膜を薄くすることでより微細な構造を作製することができます。また二次元パターン形状をデザインすることで、例えば長方形のパターンでは筒状構造に、平行四辺形パターンではコイル状に、放射状パターンでは球状に自発的に組み立てられます（図2）。さらに、長方形の二次元パターンに穴をあけて細孔を施すことにより、外部からの物質透過性を高めることが可能となります。このような構造は、構造体内部に細胞を内包した場合、常に栄養や酸素を細胞に供給し、長期間の安定な培養が可能となるメリットがあります。

技術のポイント（2）：グラフェン三次元構造の細胞インターフェースへの応用

本技術で用いた三次元構造体の形成に必要な材料はすべて毒性がないことが知られています。そのため、グラフェンが曲がる自己組み立ての工程において、三次元構造体の内部に細胞を内包化することが可能となります（図3、動画2）。三次元構造体はグラフェンとパリレンの透明性の高い材料のみから構成されるため、内部の細胞を様々な顕微鏡を用いて観察・解析が可能となります。内包化する細胞は、培養株化細胞や生体から直接単離した初代培養細胞などさまざまな細胞に適用できます。また内包された細胞の密度や鋳型となる三次元構造の形状を制御することで、一週間ほどの培養後、任意の形状の細胞塊を作製することが可能です。例えば、海馬由来の神経細胞を筒状構造体内で培養すると、その過程で細胞体同士が結合し、ファイバ状の人工神経組織を形成することを確認しました。グラフェンとパリレンの薄膜から自己組立てされた三次元構造は堅牢性に優れるため、内部に細胞を内包化して培養すると、形状を長期間維持したまま崩壊することなく安定した細胞培養が可能となります。

技術のポイント（3）：細胞の長期培養と神経ネットワークの機能実証

本技術で作製した細孔を施したグラフェン三次元構造体に細胞を内包化すると、培養液に含まれる栄養分や酸素が透過しやすくなり、従来の細胞内包化技術と比較して長期に安定した細胞培養が可能となりました（図4、動画3）。さらに、構造体内部の神経細胞が細孔を通り抜け、構造体外部にまで神経突起を伸展させる様子を観測しました（図4）。この伸展した神経突起を介して構造体内部と外部との神経細胞同士が接続し、同期して自発発火する様子が観察されました。すなわち、神経細胞同士でネットワーク構造を形成し、三次元構造体の内外で細胞間相互作用を行っている様子が実証されました（動画4）。

今後の展開

本研究では二次元材料であるグラフェンを用いて、透明性と生体適合性に優れた三次元構造を自発的に、かつ任意の形状に形成する技術を提案しました。さらに、材料の高い生体適合性と堅牢性を利用することにより、自己組立てされた三次元構造の内部に細胞を内包化し、長期に安定して培養することが可能となりました。本手法は、再生医療分野や単一細胞の挙動解析のための足場構造としての応用だけでなく、グラフェンの導電性を活かして生体内埋め込み用電極素子などの新たなバイオインタフェースとしての応用が期待されます。

論文掲載情報

行った実験の説明

本研究で用いる薄膜の材料として、炭素一層からなるグラフェンシートと、厚さが50nm～500nm程度のパリレンの2種類の材料を用いました。これらとともに、基板との接着剤となるアルギン酸カルシウムゲル（※4）の薄膜を加えた3種類が積層された多層薄膜を基板上に作製しました。この多層薄膜は、グラフェン層およびパリレン層の膜厚を変化させることが可能であり、またリソグラフィ技術を用いて任意の二次元パターン形状に成型加工することも可能です。
アルギン酸カルシウムゲルは、エチレンジアミン四酢酸（※5）やクエン酸ナトリウム溶液などを用いて瞬時に溶解することが可能です。この細胞毒性のない反応によって、基板からグラフェンとパリレンを張り合わせた二重膜の薄膜を遊離することができます。エチレンジアミン四酢酸を添加した後、薄膜の外周から徐々にアルギン酸カルシウムゲルが溶解されていき、それと同時に薄膜が三次元構造に変形していく様子を観察しました。この三次元の筒状構造への変形の場合、グラフェンは筒状構造の外側に存在し、内側にパリレンを巻き込む形で構造を形成することを確認しました。

図表

図1：単層グラフェンの転写による高分子薄膜の三次元自己組み立て

パリレンからなる高分子薄膜にグラフェンを転写することにより、お互いに高密着性を有する二重膜が形成されます。犠牲層（アルギン酸カルシウムゲル）の除去により基板から二重膜が剥離され、同時にグラフェンが外側、パリレンが内側になるように自発的に三次元の筒状構造に組み立てられます。最終的な三次元構造は、薄膜の厚みや二次元パターン形状、グラフェンの結晶方向などのパラメータにより制御できます。

図2：さまざまな二次元パターン形状から形成される三次元自己組み立て構造